代謝工程在芳香族化合物微生物降解研究中的應(yīng)用

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　　工業(yè)技術(shù)的迅猛發(fā)展，給人類社會帶來了高度的物質(zhì)文明，但也帶來了許多負(fù)面效應(yīng)，尤其是對人類生存環(huán)境造成的危害。芳香族化合物是一類廣泛存在于自然環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定，具有很大的毒性和致癌、致突變作用，而且一般都有較好的脂溶性，可以在人體和動物的脂肪組織內(nèi)積蓄，從而造成長期的危害。人工合成的芳香族化合物在利用時不可避免的泄漏到環(huán)境中造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，盡管人們已經(jīng)認(rèn)識到了問題的嚴(yán)重性，這一問題仍呈上升的趨勢^[1]。

　　微生物降解環(huán)境污染物由于投資少、占地小又不需特殊設(shè)備而成為最有前途的治理環(huán)境污染的方法。但微生物細(xì)胞在代謝繁殖過程中，經(jīng)濟(jì)合理地利用和合成自身所需的各種物質(zhì)和能量，這種固有的代謝網(wǎng)絡(luò)相對實際應(yīng)用而言其遺傳特性并非最佳,所以有必要對細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行有目的的改造。

　　1  代謝工程

　　代謝工程的基本理論和應(yīng)用就是在這一背景下發(fā)展起來的。1991年Bailey^[2]在“Science”上發(fā)表了一篇重要的綜述文章“Toward a Science of Metabolic Engineering”，標(biāo)志著代謝工程作為一門新學(xué)科的誕生。十多年來，代謝工程的理論和應(yīng)用迅速發(fā)展。1995年Bailey^[3]又發(fā)表了“Chemical Engineering of Cellular Processes”的長篇文章，詳細(xì)討論了生物網(wǎng)絡(luò)工程及代謝工程。1996年召開了第一次國際代謝工程會議(ME-I)。此后，國際代謝工程會議定期兩年舉行一次。1998 年出版了國際上第一部代謝工程教科書：“Metabolic Engineering : Principles and Methodologies”^[4]。1999年出版了“Metabolic Engineering”^[5]專著。近幾年的主要研究進(jìn)展可參見“Current Opinion in Biotechnology”等綜述性刊物及其他一些刊物上的綜述文章，例如：用代謝工程改進(jìn)染料生產(chǎn)及使用^[6]；乳酸菌的代謝工程^[7,8]；工業(yè)微生物過程的代謝途徑工程—進(jìn)化、組合生物合成及合理設(shè)計^[9]；利用基因組學(xué)進(jìn)行反向代謝工程^[10]；代謝通量分析進(jìn)展^[11]。十多年的實踐表明：代謝工程已經(jīng)成為化學(xué)反應(yīng)工程的一個新的前沿，代謝工程的應(yīng)用范圍及作用正在不斷擴(kuò)大，已經(jīng)成為菌種改進(jìn)的平臺技術(shù)。我國的代謝工程研究也已展開，國家基金委及科技部資助的一些代謝工程研究項目或部分涉及代謝工程內(nèi)容的項目正在進(jìn)行。但總的說來，無論是政府及企業(yè)的投入、還是研究隊伍及研究水平等方面看，我國代謝工程的總體研究水平及應(yīng)用均與國際先進(jìn)水平有較大差距。

　　代謝工程是一門利用分子生物學(xué)原理系統(tǒng)分析細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)、并通過DNA重組技術(shù)合理設(shè)計細(xì)胞代謝途徑及遺傳修飾，進(jìn)而完成細(xì)胞特性改造的應(yīng)用性學(xué)科。其核心內(nèi)容是對細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功利性修飾，以更好地利用細(xì)胞代謝進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化、能量轉(zhuǎn)導(dǎo)和超分子組裝，完成這一過程首先要對細(xì)胞的分解代謝和合成代謝中的多步級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行合理設(shè)計，然后利用DNA重組技術(shù)強化和(或)滅活控制代謝途徑的相關(guān)基因^[12]。代謝工程把細(xì)胞的生化反應(yīng)看作一個整體，假定細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)、能量處于一擬穩(wěn)態(tài)，通過測定胞外物質(zhì)濃度根據(jù)物料平衡計算細(xì)胞內(nèi)的代謝流，并針對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的不穩(wěn)定性，揭示細(xì)胞代謝的動態(tài)變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建新的代謝途徑，將具有特定目的的工程菌應(yīng)用于實際操作。

　　2  代謝工程在芳香族化合物生物降解中的應(yīng)用

　　利用代謝工程，改變微生物細(xì)胞原有的代謝途徑，提高其降解污染物的能力，對于控制和治理芳香族化合物的污染具有重要的意義。本文綜述代謝工程在幾類芳香族化合物生物降解中的應(yīng)用。

　　2.1  苯及烷基取代苯的降解

　　苯的降解主要是由苯雙加氧酶攻擊苯環(huán)，形成鄰苯二酚，鄰苯二酚進(jìn)一步通過間位或鄰位雙加氧酶的作用而產(chǎn)生粘康酸半醛或粘康酸，之后被進(jìn)一步降解。對于烷基取代苯，取代基團(tuán)的存在使苯環(huán)的降解出現(xiàn)兩種可能：先攻擊苯環(huán)或先攻擊側(cè)鏈。如果側(cè)鏈很長，微生物就不會降解苯環(huán)，因為側(cè)鏈的氧化已經(jīng)足夠提供生長的能量；而對于側(cè)鏈較短的烷基取代苯，一般是通過加氧酶的作用，在2，3碳位上形成二酚，再由2，3-雙加氧酶或1，2-雙加氧酶將其開環(huán)裂解。其中，以甲苯降解酶系統(tǒng)的研究較多。降解途徑如圖1所示。

　　圖1  甲苯的降解途徑

　　甲苯降解酶的基因位于質(zhì)粒pWW0上，可利用不同類型的芳烴如甲苯、二甲苯作為唯一碳源和能源。質(zhì)粒上的代謝基因組成兩個操縱子，xylCBA編碼降解甲苯和二甲苯為苯甲酸和羥基苯甲酸的酶的基因，xylDLEGFJKIH編碼由苯甲酸和羥基苯甲酸到乙醛和丙酮酸的降解酶的基因。盡管甲苯的途徑具有很廣泛的底物范圍，但它卻不能利用苯作為底物，這限制了對石油污染物的降解。已有研究表明，克隆編碼甲苯還原酶的基因todC1C2BA，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入P.putida mt-2中，則可徹底降解苯、甲苯和二甲苯^[13]。

　　因此，此類物質(zhì)的降解，主要是經(jīng)由加氧酶的作用，使得苯環(huán)的2，3位羥化，形成不穩(wěn)定的鄰苯二酚類物質(zhì)，然后開環(huán)降解。其中加氧酶起很重要的作用。在甲苯降解過程模擬的基礎(chǔ)上對代謝流進(jìn)行分析，增加甲苯雙加氧酶的活力可以使穩(wěn)態(tài)流從0.074增加到0.091。所以，增加甲苯雙加氧酶編碼基因的拷貝數(shù)，可以提高降解菌的降解能力；如果將甲苯雙加氧酶編碼基因和基因todC1C2BA同時引入上述的P.putida mt-2中，其降解能力也會增強。

　　2.2  酚類的降解

　　苯酚是一種常見的酚類物質(zhì)。苯酚的好氧降解是將苯酚分解為鄰苯二酚，鄰苯二酚由鄰位和間位途徑經(jīng)環(huán)裂解，最后形成三羧酸循環(huán)中間物。厭氧代謝的第一步是將苯酚羧化為4-羥基苯甲酸。苯酚的降解基因通常成簇排列，位于大質(zhì)粒上或染色體上。在好氧菌中，苯酚羥化酶基因是降解苯酚的關(guān)鍵基因，編碼苯酚降解途徑的第一個酶，將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚；鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23 O，間位裂解)，或1，2-雙加氧酶(CatA,鄰位裂解)將鄰苯二酚開環(huán)裂解為三羧酸產(chǎn)物^{[14，15]}。如圖2所示。

　　圖2  苯酚的降解途徑

　　注：CatA為1，2-雙加氧酶；C23 O為2，3-雙加氧酶。

　　Giovanni等^[16]研究了Candida aquaetextoris酵母對4-壬基苯酚（pNP）的生物降解，結(jié)果顯示，主要的代謝物為對羥基苯乙烯酸和4-乙酰苯酚。進(jìn)一步的研究認(rèn)為，對羥基苯乙烯酸可以被繼續(xù)降解，但4-乙酰苯酚則會積累。通過分析4-乙酰苯酚的分子結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)它是苯酚的對位衍生物，如果在Candida aquaetextoris酵母中引入苯酚羥化酶基因，使得C.aquaetextoris酵母也可產(chǎn)生苯酚羥化酶，則4-乙酰苯酚也有可能被進(jìn)一步降解；另外，4-壬基苯酚（pNP）也是苯酚的衍生物，苯酚羥化酶基因的引入，也可能使得pNP第一步就發(fā)生羥化，再經(jīng)由開環(huán)而被降解?？梢哉J(rèn)為，對于其他的苯酚衍生物，如果鄰位沒有被取代，都可以先由苯酚羥化酶羥化，然后再被降解。

　　2.3  氯代芳香族化合物的降解

　　氯代芳香化合物從結(jié)構(gòu)上說是指芳香烴及其衍生物中一個或幾個氫原子被氯原子取代后的產(chǎn)物，氯原子的引入引起芳烴本身結(jié)構(gòu)改變，造成氯代芳香化合物的生物降解性比芳烴類化合物要低很多。下面介紹氯苯、多氯聯(lián)苯等幾類物質(zhì)的降解。

　　氯苯是化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的一類化合物。因為氯原子有較高的電負(fù)性，強烈吸引苯環(huán)上的電子，使苯環(huán)成為一個疏電子環(huán)，導(dǎo)致很難發(fā)生親電反應(yīng)。與碳?xì)浠衔锵啾龋捎诼仍拥囊肫渖锝到庑源蟠蠼档?，因此生物處理很難降解氯苯類化合物。但是有些微生物通過自然變種，或通過形成誘導(dǎo)酶，能夠?qū)⒙缺筋惢衔锝到饣虿糠洲D(zhuǎn)化。氯苯類化合物降解的關(guān)鍵在于脫氯，根據(jù)脫氯過程中電子得失，將氯苯類化合物生物降解分為氧化脫氯和還原脫氯。

　　對于氯取代基在3個以下的氯苯，好氧條件下的降解基本上是先開環(huán)再脫氯。即在雙加氧酶和去氫酶的作用下，將氯苯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氯代鄰二酚，再由可使苯環(huán)發(fā)生鄰位裂解的酶催化氯代鄰二酚鄰位開環(huán),生成相應(yīng)的氯代粘康酸，此產(chǎn)物在內(nèi)酯化過程中脫除氯原子并被氧化成氯代馬來?；宜?，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)。一氯苯的降解^[17]如圖3所示。

　　圖3  一氯苯的降解途徑

　　在雙加氧酶作用下發(fā)生雙羥基化反應(yīng)，生成3-氯鄰二酚。此中間體鄰位裂解后形成2-氯-2,4-二烯-己二酸(即2-氯-粘康酸)。脫氯過程發(fā)生在粘康酸內(nèi)酯化形成4-羧甲烯基-2-丁烯-4-內(nèi)脂的過程中。產(chǎn)物含有不飽和雙鍵，可以被逐步還原，生成只含一個不飽和鍵的順丁烯二?；宜?即馬來?；宜?和碳鏈完全飽和的3-羰基-己二酸，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)。二氯苯和三氯苯的降解，基本上與一氯苯類似，第一步也是雙氧化作用生成二酚，氧化位點是連續(xù)兩個沒有氯取代基的碳原子，再經(jīng)過開環(huán)被降解。但如果氯取代基達(dá)到4個或更多，則將進(jìn)行先脫氯后開環(huán)再脫氯的催化反應(yīng)，即在單加氧酶作用下，由羥基取代氯原子，再經(jīng)過單加氧酶的進(jìn)一步作用，形成開環(huán)裂解的中間體氯代鄰二酚，才能進(jìn)一步降解。

　　在氯苯的降解途徑中，鄰苯二酚是一種不穩(wěn)定的中間物，因此由氯苯到氯代鄰二酚是關(guān)鍵步驟，雙加氧酶和去氫酶是關(guān)鍵酶，根據(jù)代謝工程原理，增加其編碼基因的拷貝數(shù)，加快此一步驟，從而加速氯苯到中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，提高降解速率。同時，增加裂解酶的活力，可消除鄰二酚的積累，使得整個途徑順利進(jìn)行。

　　氯苯的還原脫氯^[18]是指得到電子的同時去掉一個氯取代基，并釋放出一個氯陰離子的過程。其厭氧生物降解機制主要是在酶催化作用下由氫取代氯，發(fā)生脫氯反應(yīng)，使得氯取代基減少，再通過氧化脫氯途徑降解。

　　另外，共代謝機制也是降解氯苯類化合物的一種手段。即選擇易被微生物利用的、與目標(biāo)降解物結(jié)構(gòu)類似的生長基質(zhì)，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生是目標(biāo)降解物轉(zhuǎn)變的酶^[19]，從而使得氯苯降解。

　　多氯聯(lián)苯（PCBs）是一組有一個或多個氯原子取代聯(lián)苯分子中的氫原子而形成的氯代芳香族化合物，有極強的穩(wěn)定性，在自然界中很難被降解，但還是有一些微生物可以降解PCBs的。Seeger^[20]、Arsendorf^[21]、Abramowicz^[22]等研究認(rèn)為，對于氯取代位點集中在一個苯環(huán)上的氯代聯(lián)苯，一些細(xì)菌菌株，可通過在無氯取代苯環(huán)的2，3碳位上間位開環(huán)降解一氯、二氯、三氯及一些四氯聯(lián)苯。降解途徑是在2，3雙加氧酶的作用下生成氯代苯甲酸和4-羥基戊酸，4-羥基戊酸可被降解菌株徹底礦化，氯代苯甲酸需被其他微生物進(jìn)一步降解。一般而言，雙加氧酶優(yōu)先攻擊無氯取代的苯環(huán)，但如果2，3碳位上無障礙，氧化反應(yīng)也可以發(fā)生在有氯取代的環(huán)上^[23]。由于自然界中的PCBs降解菌株的修復(fù)效率比較低，所以有必要通過基因構(gòu)建的方法獲得高效的工程菌。Brenner等^[24]通過研究，確定了假單胞菌LB400中表達(dá)2，3-聯(lián)苯雙加氧酶（bphA），2，3-二氫雙醇脫氫酶（bphB），2，3-二羥聯(lián)苯1，2-雙加氧酶（bphC）及2羥6氧6苯基2，4-二烯水解酶（bphD）的基因序列，并利用2，3-雙加氧酶途徑和寬宿主范圍的質(zhì)粒構(gòu)建了重組菌株，4個PCBs降解酶基因的長度為12.4 kb，含有上述降解酶基因的大腸桿菌可以直接利用PCBs，而且不需要聯(lián)苯誘導(dǎo)。

　　2-氯甲苯（2-chlorotoluene）也是一類較難降解的氯代芳香族化合物。Maria等^[25]對2-氯甲苯的代謝降解途徑進(jìn)行了深入的研究，并構(gòu)建了可以降解2-氯甲苯的假單胞工程菌。組合的途徑包括：一個編碼甲苯雙加氧酶基因（todC1C2BA）的片段，從菌株Pseudomonas putida F1的TOD系統(tǒng)獲得，可以將2-氯甲苯轉(zhuǎn)化為2-氯苯甲醛；另一個片段來自Pseudomonas putida mt-2菌株的PWW0質(zhì)粒，編碼整個TOL途徑，表達(dá)的苯甲醇脫氫酶（由xylB編碼）和苯甲醛脫氫酶（由xylC編碼），可以將2-氯苯甲醇轉(zhuǎn)化為2-氯苯甲酸。將上述的TOL和TOD片段組合到單個的mini-Tn5轉(zhuǎn)座子，再將此轉(zhuǎn)座子整合到2-氯苯甲酸降解菌Pseudomonas aeruginosa PA142和Pseudomonas aeruginosa JB2的染色體上，然后通過實驗，證明的確可以將2-氯甲苯礦化，具體的降解途徑是：2-氯甲苯轉(zhuǎn)化為2-氯苯甲醇，再轉(zhuǎn)化為2-氯苯甲醛，再轉(zhuǎn)化為2-氯苯甲酸，PA142先將2-氯苯甲酸轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，再經(jīng)由三羧酸循環(huán)而降解；而JB2則將2-氯苯甲酸轉(zhuǎn)化為3-氯鄰苯二酚，然后由三羧酸循環(huán)降解。但實驗同時證明，PA142和JB2都不能將2-氯甲苯作為唯一的碳源。如圖4所示。

　　圖4  2-氯甲苯的降解途徑

　?。▓D中：todC1C2BA為編碼甲苯雙加氧酶的基因；xylB為苯甲醇脫氫酶；xylC為苯甲醛脫氫酶；JB2和PA142為2-氯苯甲酸降解菌）

　　2.4  多環(huán)芳烴的降解

　　多環(huán)芳烴（PAHs）是指2個或2個以上的苯環(huán)稠合在一起的一類化合物，在環(huán)境中的性質(zhì)穩(wěn)定，具有強烈的毒性。PAHs不易被微生物降解，但不是不能降解。在微生物分泌的單加氧酶和雙加氧酶催化作用下，把氧加入到苯環(huán)上，形成C-O鍵，再經(jīng)過加氫、脫水等作用而使C-C鍵斷裂，苯環(huán)數(shù)減少。其中真菌產(chǎn)生單加氧酶，加一個氧原子到苯環(huán)上，形成環(huán)氧化物，然后，加入H₂O產(chǎn)生反式二醇和酚。細(xì)菌產(chǎn)生雙加氧酶，加兩個氧原子到苯環(huán)上，形成過氧化物，氧化為順式二醇，脫氫產(chǎn)生酚。最后，這些中間產(chǎn)物由微生物降解^[26]。

　　萘是最簡單的多環(huán)芳烴，生物降解途徑與其他芳香化合物基本相同，第一步是雙加氧酶進(jìn)攻苯環(huán)形成1，2 羥基萘，隨后在第1和第9個碳原子間斷裂開環(huán)，苯環(huán)數(shù)減少。其他多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)相對要復(fù)雜，降解也較難。Juhasz等^[27]研究了細(xì)菌和真菌降解苯并(ａ)芘的機理，結(jié)果顯示，細(xì)菌雙加氧酶從不同位點進(jìn)攻苯并(ａ)芘,先是形成順二氫二醇型中間產(chǎn)物,然后是一系列的酶促反應(yīng)；真菌代謝苯并(ａ)芘最初的產(chǎn)物是反二氫二醇，代謝中起作用的都是P-450單加氧酶。根據(jù)代謝工程原理，可以通過分析細(xì)菌和真菌的代謝網(wǎng)絡(luò)，確定雙加氧酶和單加氧酶所對應(yīng)的基因，并增加這些基因的拷貝數(shù)，強化苯并(ａ)芘到中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。

　　3 討  論

　　綜上所述，各類芳香族化合物的生物降解途徑基本上是一致的，先由雙加氧酶或單加氧酶的作用，形成鄰二酚類物質(zhì)，然后在鄰苯二酚2,3雙加氧酶（C23 O）或1,2雙加氧酶（CatA）的作用下，開環(huán)進(jìn)入后續(xù)降解步驟。Eltis等的研究也證實了這一過程。因此，在實際的應(yīng)用中，把上述幾個酶的編碼基因克隆并重組成一個質(zhì)粒，導(dǎo)入已發(fā)現(xiàn)的假單胞菌等芳香族化合物的降解菌，將大大提高轉(zhuǎn)化降解的速率。

　　根據(jù)代謝工程的基礎(chǔ)理論，通過操作，原則上可以將所有的降解酶基因和質(zhì)粒集合到某一菌株，人工制造出降解各類芳香族化合物的超級工程菌。但在實際的操作中，往往存在一些問題，無法達(dá)到預(yù)期的改造效果。

　　生物細(xì)胞經(jīng)過人工的改造，引入外源基因或改變原有的代謝途徑，理論上可以達(dá)到特定的目的，但細(xì)胞本身是一個整體，物質(zhì)流的改變必然會影響到能量流，過量的某種基因的表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)供能不足和內(nèi)部生理功能的混亂，從而影響到對污染物的降解。對此，可以考慮利用共代謝降解，通過投加特定的基質(zhì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生新的降解酶，減少酶的表達(dá)數(shù)量，不致出現(xiàn)能量不足的情況。

　　由于質(zhì)粒的遺傳具有相對的獨立性，引入微生物細(xì)胞的質(zhì)粒，經(jīng)過幾代的培養(yǎng)，很可能丟失，導(dǎo)致工程菌失效；進(jìn)入環(huán)境的質(zhì)粒也可能污染其他的菌種，造成潛在的環(huán)境風(fēng)險性。可以將目標(biāo)基因直接整合到菌株的DNA上，增加遺傳的穩(wěn)定性。

　　另外，芳香族化合物的水溶性一般都比較差，因此在利用微生物降解時，由于不大容易進(jìn)入細(xì)胞而使生物利用度較低，通過投加一定量的表面活性劑，可以促進(jìn)芳香族化合物進(jìn)入水相，從而更好地被降解。

　　隨著人們對芳香族化合物污染的重視程度的提高以及科學(xué)研究的深入，芳香族化合物污染治理取得了一定的進(jìn)展。生物修復(fù)技術(shù)是芳香族化合物污染環(huán)境治理最有前景的手段。對生物降解途徑的研究，特別是基因序列研究的不斷深入，應(yīng)用代謝工程原理分析降解途徑，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)造高效的降解途徑，構(gòu)建高效的基因工程菌，同時尋找最佳的降解條件，促進(jìn)大氣、水體、土壤各環(huán)境體系中芳香族化合物污染的綜合治理，最終控制和解決芳香族化合物環(huán)境污染問題。

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　　[1]第一作者：謝國建，男，1981年生，碩士研究生，主要研究方向為環(huán)境生物技術(shù)。#通訊聯(lián)系人。